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爲什麽細胞養不好?你可能忽略了這些細節

提供者:上海古朵生物科技有限公司   发布时间:2020/6/22  阅读次数:56次   進入該公司展台

細胞培養時中常遇到的那些不可忽視的問題,及我們該如何解決呢?

一、細胞的營養來源

針對大多數腫瘤細胞,營養配方一般爲:90%合成培養基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);爲了防止汙染,可以加1%雙抗!

常見問題解答:

Q:針對不同細胞,細胞培養基配方一樣嗎?如何獲知呢?

A:不同細胞的培養基是不同的。一般ATCC購買的細胞,針對不同細胞株,會有詳細介紹,包括生長的狀態圖、培養基的類型等。如人源乳腺癌細胞MCF-7細胞一般爲1640,人源肺癌細胞A549可用DMEM培養基。

Q:培養基爲什麽一般都是偏紅色?

A:因爲培養基加了酚紅來顯示顔色,指示pH範圍爲6-8,顔色會由黃變爲紫紅。這是爲了我們能更直觀觀察培養液的變化,如變黃,則代表偏酸,偏堿性了就顯示偏紫色。一般來說,細胞吸收營養後,變黃後就暗示我們要換培養基啦!所以密切觀察很重要哦!

Q:大多數細胞系可以在不止一種培養基中生長,那可以替換嗎?

A:不建議更換ATCC指定的培養基,因爲當培養基改變時,細胞的性質可能也會變化。

Q:若是細胞生長緩慢,是否可以增加血清比例?

A:可以!

二、細胞的居住環境

舒適無菌的環境是細胞健康生活的重要基礎。如下圖爲培養細胞的器皿,包括形狀、規格、用途多樣的培養瓶、培養皿及培養板。最終住進37℃,5%CO2的恒溫培養箱。

常見問題解答:

Q:細胞培養板規格不一,如何正確選用?

A:根据不同规格的細胞培养皿/板容量及用途,如流式一般用 6 孔,爬片一般用 24 孔,MTT 一般用 96 孔,等。

Q:細胞培養皿和培養瓶區別?

A:就細胞培養狀態來說,培養瓶和培養皿沒有太大區別,主要在于安全系數(培養瓶>培養皿)、培養細胞數量(大培養瓶>培養皿)。但是培養瓶成本也會相對較高,因此無特殊要求,一般選擇培養皿即可。

三、細胞的複蘇與凍存(原則是慢凍速融)

1. 細胞复苏:指将冻存的細胞解冻之后重新培养,細胞恢复生长的过程。

常見問題解答:

Q:爲什麽細胞複蘇後,很多難以貼壁?

A:忽略培養基的問題,主要考慮細胞凍存時狀態差或者複蘇時動作太慢導致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快,可不時搖動冷凍管,使之盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。

Q:爲什麽細胞貼壁了,卻長不起來?

A:此时需要考虑的是細胞密度问题,一些細胞倾向于维持一定的密度,若复苏的細胞生长缓慢,可将細胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。                                          

2. 細胞冻存 将細胞放在低温环境(-70℃~-196℃),細胞内的代谢降低,可最大限度的保存細胞活力,以便长期储存。

常見問題解答:

Q:目前細胞凍存液多采用的什麽配方?

A:目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑,細胞凍存液的配方有很多種,如培養基:血清:DMSO=7:2:1或8:1:1或5:4:1,或直接用血清:DMSO=9:1,一般高濃度血清有助于維護細胞活力,複蘇存活率在80%~90%以上。

Q:若沒有細胞凍存盒,我們該怎麽辦?

A:可先將凍存管放入4℃冰箱中10min,再移至-20℃冰箱30min,-80℃冰箱2h或過夜,最後放入液氮罐內。爲了節約時間,還可直接在凍存盒外包裹一團棉花,用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點,將細胞轉移至-80℃冰箱過夜,再轉移至液氮保存。

Q:細胞凍存時對細胞量有要求嗎?

A:細胞複蘇時會有一定的細胞死亡,因此細胞的濃度應足夠高,起始濃度106—107個/ml/管;

四、細胞的傳代培養

細胞傳代:細胞在培養過程中不斷增殖,培養皿/瓶空間有限,當細胞接觸過密,生長就會受到抑制,影響細胞狀態,因此我們要把其中一部分細胞分到別的培養皿/瓶裏。

常見問題解答:

Q:爲什麽我們總說選擇對數期細胞傳代?

A:細胞的生長和分裂,一般遵循以下模式:停滯期,對數期(指數期),平穩期(平台期)和衰退期。爲了確保活力,遺傳穩定性和表型穩定,必須使細胞保持在對數期。

Q:那如何確定細胞對數期?

A:根据上述細胞生长曲线,为了确保活力,必须使細胞保持在对数期就传代,所以一定不能等到細胞长满100%融合时才去消化传代。一般細胞长到 70% -80%左右即可传代。

Q:一般細胞傳代都是1分2嗎?

A:要根据不同細胞而定,如有的生长很快,比如说4T1細胞,传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢,比如 BT474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。

Q:消化很關鍵嗎?

A:不得不說,細胞狀態差,很多時候與傳代時胰酶消化密切相關。一般腫瘤細胞消化1-2min即可。但是每一種細胞貼壁能力不同,因此對胰酶的反應也不同,我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀察到貼壁細胞層能移動即可終止;而非細胞全部分散成單個。

Q:部分比較難消化的細胞怎麽辦?

A:可放于37℃培養箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細胞爲例,放于37℃培養箱消化5-8min,輕輕拍打,才見細胞成片移動,因此針對難消化細胞一定要在顯微鏡下密切觀察。

Q:幾天換培養基?

A:正常情況下,培養液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5~6.6條件下,培養基變黃,說明培養液中代謝産物已堆積到一定量,細胞會脫落死亡,需要更換新鮮培養液。一般細胞生長旺盛時1~2天換一次,生長緩慢時,3~4天亦可。針對複蘇後的細胞,建議隔天換液。

Q:每天觀察細胞有必要嗎?

A:一般的腫瘤細胞我們是隔天傳代,但是切不可忽略對細胞的觀察,一定要每天都要去看一下細胞,肉眼觀察培養基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。記住,是每天。

Q:如果細胞形態不清晰或有異物等,如何處理?

A:可以考慮如下操作:首先,倒掉舊的培養基,用新的培養基或者PBS洗滌2-3次,再開始正式的消化、吹打。其次,把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養瓶內。後續再密切觀察。

Q:細胞汙染怎麽辦?

A:如發現細胞有汙染,一般應立即丟棄。如果細胞非常寶貴,可試著加入含抗生素的培養基反複清洗,並用抗生素含量高的培養基培養,並經常更換培養基.

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